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EIAV标记感染性克隆分子的构建

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【作者】 温建新童光志王金宝仇华吉涂亚斌

【Author】 WEN Jian-xin~1,TONG Guang-zhi~2,WANG Jin-bao~3,QIU Hua-ji~2,TU Ya-bin~2(1.College of Animal Science and Technology,LAC,Qingdao 266109,China;2.Harbin Veterinary Research institute of CAAS;3.Agriculture Research Institute SAAS;4.College of Animal Science and Technology,Shandong Agriculture University)

【机构】 莱阳农学院动物科技学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所山东省农业科学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 山东青岛266109山东农大动物科技学院

【摘要】 应用已构建好的EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆载体(pOK8266)为模板,通过SOE PCR方法在感染性分子克隆载体的S2基因独特区内引入突变点,形成含有酶切位点(NspV)的突变体(P1P4)。将突变体(P1P4)亚克隆至pB luescript SK(M13-)质粒,形成pB-P1P4中间载体;人工合成两条6个组氨酸的引物,作为标签,将其插入pB-P1P4中间载体的NspV位点,形成带标签的中间载体;用ApaI酶切pOK8266和中间载体,连接转化,构建带标签的重组感染性分子病毒克隆载体(EIAV-p8.2-H IS),经PCR、酶切和测序表明,6个组氨酸已插入pOK8266的S2基因内。分别转染驴皮肤细胞(FDD)和驴白细胞,将转染驴皮肤细胞收获物传至第六代,电镜下未观察到EIAV病毒;而将转染驴白细胞收获物传代至第6代时,电镜下观察到了典型的病毒粒子。提取前病毒DNA,PCR扩增P1P4片段,亚克隆至pMD18-T载体,测序证明前病毒DNA含有6个组氨酸,从而在体外获得了感染性克隆病毒株。本研究通过SOE法巧妙地对S2基因引入突变,插入H IS标签,成功地获得了标记感染性分子克隆,证明S2基因缺失突变株在体外巨嗜细胞上培养不影响其复制力,为野毒株和疫苗毒的鉴别诊断打下基础。

【基金】 “十五”“863计划”项目:马传贫和禽流感病毒分子生物学及疫苗研究(2001AA223041)
  • 【分类号】S852.65
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