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重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

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【作者】 杨芳易山李鸿钧谢天宏施锐孙茂盛

【Author】 YANG Fang,YI Shan,LI Hong-jun,et al(Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Kunming 650118,China)

【机构】 中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室 昆明650118昆明650118

【摘要】 目的构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体。方法以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)。氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录。以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml。经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致。流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。

【所属期刊栏目】 基础研究 (2007年09期)
  • 【DOI】10.13200/j.cjb.2007.09.10.yangf.017
  • 【分类号】Q78
  • 【被引频次】4
  • 【下载频次】131
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