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体外拼装苦瓜降糖多肽P基因

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【作者】 张文姬王碧莲郭茸恺赵健王富军

【Author】 ZHANG Wen-ji,WANG Bi-lian,GUO Rong-kai,ZHAO Jian,WANG Fu-jun(State Key Laboratory of Bioreac-tor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

【机构】 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

【摘要】 目的 以苦瓜降糖多肽P基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法根据已知苦瓜降糖多肽P的蛋白序列和大肠杆菌的密码子偏爱性,反向翻译出可在大肠杆菌内表达的苦瓜降糖多肽P基因,设计24条40 bp的降糖多肽P基因寡核苷酸片段引物,通过PCR进行寡核苷酸片段的扩增和拼装。将拼装好的多肽P基因的cDNA与pET-32a载体连接后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA纯化后检测其对四氧嘧啶引起的糖尿病小鼠的降糖活性。结果苦瓜降糖多肽P基因经2轮PCR扩增后,即可见目的 条带;经第3轮PCR扩增,即可见清晰的目的 条带。经测序鉴定,与设计的降糖多肽P基因序列完全一致。重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得可溶性表达,且可与鼠抗His单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度达90%以上,产量为10 mg/L,其对四氧嘧啶引起的糖尿病小鼠具有降糖活性。结论体外基因拼装法是一种有效获取目的 基因的方法,可进行密码子偏爱性设计,在宿主系统中有效表达目的 基因。

【基金】 国家十一五支撑计划(2006BAI06A162007-2009)
【所属期刊栏目】 实验技术 (2011年01期)
  • 【DOI】10.13200/j.cjb.2011.01.100.zhangwj.005
  • 【分类号】Q78
  • 【被引频次】1
  • 【下载频次】157
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