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基于IRES序列的多基因共表达载体构建

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【作者】 田聪慧谢雪梅李英尹晓东韩军李军

【Author】 TIAN Cong-hui;XIE Xue-mei;LI Ying;YIN Xiao-dong;HAN Jun;LI Jun;School of Pharmacy and Institute of Bio Pharmaceutical Rescarch,Liaocheng University;Yixing Cell Biotechnology Limited Company;

【机构】 聊城大学药学院生物制药研究院宜兴市赛尔生物科技有限公司

【摘要】 目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和HeLa两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白质免疫印迹实验表明,DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组,并且两种蛋白质表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。

【关键词】 IRES载体构建基因共表达
【基金】 国家自然科学基金青年项目(81402512);聊城市科技发展计划项目(2014GJH11);泰山学者工程专项资助项目
【所属期刊栏目】 技术与方法 (2017年07期)
  • 【DOI】10.13523/j.cb.20170716
  • 【分类号】Q78
  • 【被引频次】1
  • 【下载频次】145
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