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慢病毒载体表达小鼠LAL对肝细胞的作用

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【作者】 李皓李菲菲李文婧曹佳喻红吴东方

【Author】 LI Hao;LI Feifei;LI Wenjing;CAO Jia;YU Hong;WU Dongfang;Dept.of Pharmacy,Zhongnan Hospital of Wuhan University;Dept.of Biochemistry and Molecular Biology,Wuhan University School of Basic Medical Sciences;

【机构】 武汉大学中南医院药学部武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学系

【摘要】 目的:为探讨溶酶体酸脂酶(LAL)在代谢性疾病的功能及作用机制,本实验构建小鼠源性LAL基因的慢病毒表达载体,并研究LAL在肝细胞中高表达的作用。方法:根据C57BL/6J小鼠肝脏cDNA文库设计对应引物,定点诱变PCR扩增得到两端含PacⅠ酶切位点的目的基因,经酶切连接至pWPI-GFP慢病毒载体后筛选并测序鉴定。重组载体经Lipofectamine 2000瞬时转染至小鼠Hepa 1-6肝癌细胞系,荧光显微镜观察GFP表达反映转染效率,利用30μg/ml氧化的LDL(ox-LDL)孵育细胞8h作为氧化应激条件,实时定量PCR(qPCR)检测目的基因LAL及肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)等基因的mRNA水平。结果:所构建的pWPI-LAL慢病毒表达载体序列正确,瞬时转染Hepa 1-6细胞有效升高LAL的mRNA表达水平;与基础及氧化刺激下的对照组相比,LAL表达均显著降低炎症相关基因TNFα、IL-6的mRNA水平(P<0.01)。结论:成功构建的pWPI-LAL慢病毒载体可在肝细胞内有效表达,并发挥抗炎作用。

【基金】 国家自然科学基金资助项目(编号:81570417,81670423)
【所属期刊栏目】 基础医学研究 (2017年05期)
  • 【DOI】10.14188/j.1671-8852.2017.05.002
  • 【分类号】R58
  • 【下载频次】28
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