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大肠杆菌γ-ggt原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt的构建及其蛋白表达

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【作者】 胥俊峰单建华赵宁伟殷志敏

【Author】 XU Jun-feng et al(College of Life Science,Nanjing Normal University,Nanjing,Jiangsu 210046)

【机构】 南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院 江苏南京210046江苏南京210046

【摘要】 构建大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt及表达与鉴定目的蛋白,为进一步利用该酶催化合成茶氨酸等目的产物奠定了基础。以大肠杆菌DH5α总DNA为模板,用PCR法在γ-ggt编码序列上下游引入酶切位点并扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因;将γ-ggt编码序列克隆入原核表达载体pGEX-4T-1的相应酶切位点;用PCR鉴定重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt,并对插入基因片断测序;重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导后用SDS-PAGE分析表达产物,并经Westernblot鉴定。获得大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因,并成功构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化有pGEX-4T-1/γ-ggt工程菌BL21(DE3)经1 g/L乳糖诱导1 h后即开始表达目的蛋白,在诱导6 h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot鉴定了此目的蛋白。成功构建了大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt,并进行了目的蛋白的鉴定。

【关键词】 γ-谷氨酰转肽酶克隆表达
【基金】 国家教育部基金项目(2002SWXSBJBC22)
【所属期刊栏目】 农业生物技术 (2007年30期)
  • 【DOI】10.13989/j.cnki.0517-6611.2007.30.076
  • 【分类号】Q78
  • 【被引频次】6
  • 【下载频次】723
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