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人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

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【作者】 张曦潘玉卿李静芳杨伟高艳章魏颖石琼夏全松杨丽

【Author】 ZHANG Xi;PAN Yuqing;LI Jingfang;YANG Wei;GAO Yanzhang;WEI Ying;SHI Qiong;XIA Quansong;YANG Li;Department of Clinical Laboratory,Caner Hospital of Yunnan Province,Third Affiliated Hospital,Kunming Medical University;Department of Clinical Laboratory,First Affiliated Hospital,Kunming Medical University,Yunnan Institute of Experimental Diagnosis,Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine;

【通讯作者】 石琼;杨丽;

【机构】 云南省肿瘤医院·昆明医科大学第三附属医院检验科昆明医科大学第一附属医院检验科云南省实验诊断研究所云南省检验医学重点实验室

【摘要】 目的:构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)发生发展中的相关机制。方法:采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果:提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×106 CFU·mL-1,转化后原始菌液共计5mL,总库容量为1.25×107 CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1 200bp,阳性率为100%。结论:成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。

【基金】 国家自然科学基金地区项目资助课题(81760426);云南省科技厅-昆明医科大学联合专项基金资助课题(2015FB070);云南省教育厅科学研究基金项目资助课题(2018JS228)
【所属期刊栏目】 基础研究 (2019年05期)
  • 【DOI】10.13481/j.1671-587x.20190507
  • 【分类号】R733.71
  • 【下载频次】42
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