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牛对氧磷酶-1蛋白多克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA检测方法的建立

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【作者】 赵畅张江范子玲白云龙孙书函宋玉曦夏成

【Author】 ZHAO Chang;ZHANG Jiang;FAN Zi-ling;BAI Yun-long;SUN Shu-han;SONG Yu-xi;XIA Cheng;College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University;

【通讯作者】 夏成;

【机构】 黑龙江八一农垦大学动物科技学院

【摘要】 目的制备牛对氧磷酶-1(paraoxonase-1,PON-1)蛋白多克隆抗体,并建立PON-1的双抗夹心ELISA检测方法。方法将重组牛PON-1蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,经AKTA蛋白纯化系统纯化抗体。以获得的多克隆抗体为捕获抗体,牛PON-1单克隆抗体为检测抗体,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,构建牛PON-1蛋白的双抗夹心ELISA检测法,并对多克隆抗体(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800)及单克隆抗体浓度(0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、3. 2、6. 4 mg/mL)、包被条件(37℃孵育2 h、4℃孵育过夜)、封闭液(1%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、0. 5 mol/L氯化铵)、封闭条件(37℃2 h、37℃4 h、4℃过夜)进行优化,同时验证方法的线性及准确度。采用该方法及市售试剂盒同时检测酮病组及对照组奶牛血清中的PON-1含量。结果建立的双抗夹心ELISA法最适检测条件为:单克隆抗体浓度为3. 2 mg/mL,多克隆抗体工作浓度为1∶800稀释,封闭液为5%脱脂奶粉,包被及封闭条件均为4℃过夜。牛PON-1蛋白标准品浓度在90~3 125 ng/mL浓度范围内,与A450值呈良好的线性关系,标准曲线方程为y=0. 618 6 x-0. 753 6,R2=0. 981 3;5份样品检测结果均值为764. 21 ng/mL,回收率为97. 97%。市售试剂盒和本实验建立方法检测酮病组奶牛体内PON-1含量均显著低于对照组(P <0. 001)。结论成功获得了抗牛PON-1蛋白的多克隆抗体,并建立了牛PON-1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,且该方法具有良好的线性及准确度。

【基金】 国家自然基金面上项目(31372488);奶牛重要群发生产性疾病群防群控技术及产品研发与示范(GA16B202);畜禽群发普通病防控技术研究(2017YFD0502200)
【所属期刊栏目】 技术方法 (2019年10期)
  • 【DOI】10.13200/j.cnki.cjb.002838
  • 【分类号】S858.23
  • 【下载频次】84
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